近日，上海交通大学医学院-国家热带病研究中心全球健康学院殷堃课题组在国际期刊Chemical Engineering Journal（IF: 13.2，中科院一区Top）在线发表题为“Heparin's inhibition capability on DNA polymerase enables probe-free heparin quantification”的研究论文。该研究围绕临床抗凝治疗中肝素精准监测的实际需求，构建了一种基于聚合酶活性抑制机制的无探针检测平台（Heparin-Inhibited Polymerase Reaction, HIPR）。通过利用工程化DNA聚合酶对肝素的特异性响应，实现扩增信号与肝素浓度的定量关联，解决传统检测流程复杂、体系依赖探针等问题，建立了简便、灵敏且具有良好抗干扰能力的肝素检测方法，为抗凝治疗精准监测技术的发展提供了新的思路和技术支撑。

肝素是临床常用的抗凝药物，在心血管手术及血栓防治过程中发挥重要作用。由于其治疗窗口较窄，剂量控制不当可能引发出血或血栓风险，因此对体内肝素浓度进行准确监测具有重要意义。现有检测方法多依赖凝血级联反应或特定识别体系，检测流程相对复杂，且易受多种血浆成分影响。

围绕上述临床需求，本研究提出“肝素抑制聚合酶反应”（Heparin-Inhibited Polymerase Reaction, HIPR）检测模式。研究发现，工程化Zst DNA聚合酶对肝素具有明显抑制响应。在环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）反应过程中，肝素的存在会延缓扩增动力学进程，通过建立LAMP反应扩增时间与肝素浓度之间的定量关系，实现对肝素的检测。该方法无需额外荧光探针或分子标记，信号输出直接来源于聚合酶活性变化（图1）。

图1：HIPR检测及其抑制机制示意图。(a) 在HIPR系统中，Zst聚合酶沿DNA底物延伸引物，同时将荧光染料掺入新生链中，导致荧光信号随时间增加。(b) 肝素的存在以剂量依赖的方式抑制Zst聚合酶的活性，阻止引物的有效延伸，从而减弱荧光产生。(c) Zst聚合酶与DNA底物结合的分子结构（上图）以及肝素破坏这种相互作用的过程（下图）,相应的荧光强度曲线突出显示了正常条件下的强信号以及添加肝素后信号的逐渐减弱。

论文在图2中系统展示了肝素对Zst DNA聚合酶扩增反应的影响。实验结果表明，随着肝素浓度增加，扩增曲线整体明显右移，扩增起始时间显著延迟，荧光信号强度逐步下降，呈现出明显的浓度依赖性抑制趋势。进一步分析显示，在一定浓度范围内，扩增阈值时间与肝素浓度之间具有良好的线性关系，为建立定量分析模型提供了实验依据（详见补充材料）。同时，对比实验表明，常用的Bst 2.0和Bst 3.0 DNA聚合酶在相同条件下几乎不受肝素影响，说明Zst聚合酶具有特异性敏感响应的特征。图2的结果不仅验证了HIPR检测策略的可行性，也为后续灵敏度优化和体系参数的确定提供了关键数据支持。

图2. 肝素对Zst聚合酶的选择性抑制作用与Bst聚合酶的抑制作用比较。(a) 在有或无5 μM肝素存在下，Zst、Bst 2.0和Bst 3.0的实时荧光扩增曲线（n = 3，数据代表三次技术重复的平均值±标准差）。(b) 琼脂糖凝胶电泳（1.5%）显示各聚合酶在有或无肝素存在下产生的扩增子条带。M：DNA ladder（100 bp）（该实验独立重复两次，结果相似）。(c) 比较各条件下的阈值时间（Cp值），结果显示仅Zst组完全抑制（n=3，数据代表三次技术重复的平均值±标准差）。对n=3个样本进行统计分析，比较Zst与Zst在肝素存在与否条件下的阈值时间差异，采用双尾t检验（p<0.0001），结果表明差异具有统计学意义。

为阐明抑制机制，研究团队开展了分子对接与分子动力学模拟分析。结果表明，肝素的高硫酸化结构通过氢键和范德华相互作用稳定结合于聚合酶表面碱性区域，从而影响其催化活性。进一步分析显示，不同糖胺聚糖之间的响应差异主要与硫酸化密度和电荷分布相关，而非严格的分子特异识别。相关结果为理解DNA聚合酶与多阴离子分子之间的相互作用提供了结构依据（图3）。

图3. Zst-肝素相互作用的分子对接和全原子MD模拟。(a) 使用Gromacs 2020.6 进行结构准备、盲对接和分子动力学模拟的整体工作流程。(b) Zst 聚合酶的预测三维结构和最佳对接姿势，显示肝素位于带正电荷的空腔中。(cd) 放大的结合界面视图，显示硫酸基团与赖氨酸/精氨酸残基之间的氢键和静电相互作用。(e) 50 ns 内主链均方根偏差 (RMSD) 显示肝素初始调整至约 0.6 nm，并在 15 ns 后稳定在约 0.4 nm 附近；配体保持在口袋中，仅有轻微波动。(f) Zst 残基的均方根波动 (RMSF) 显示波动较小，N端和C端以及卷曲片段处的RMSF值较高，表明其具有一定的流动性。(g) 肝素和Zst之间氢键的时间分辨计数。

在性能验证方面，该方法检测限为0.5 μM，在临床相关浓度范围内呈现良好线性关系（R² = 0.9596）。在人血浆样本中的加标回收率为95%–108%，重复性较好。体系在等温条件下运行，操作流程简洁，无需复杂仪器，具有一定的即时检测应用潜力。真实临床样本测试结果表明，该方法在抗凝条件下能够反映肝素水平变化趋势（图4）。

图4. 用于肝素定量分析的HIPR检测方法的性能检测。(a) 灵敏度分析显示剂量依赖性荧光抑制（DNA 底物浓度为 10⁶ copies/μL，肝素浓度分别为 0、1、2、3、4、5 和 10 μM）（n = 3，数据代表三次重复实验结果的平均值）。(b) 校准曲线显示肝素浓度与Cp值之间的相关性（R² = 0.9530）。(c) 特异性测试。在HIPR中，用与肝素浓度相同的常见阴离子和生物分子（5 μM）替代肝素。使用双尾t检验对 n = 3个样本进行统计分析，比较不同终点荧光值( p < 0.0001)，结果表明存在统计学显著差异。(d) 抗干扰测试。在本HIPR检测中，依次加入常见的阴离子和生物分子，并与浓度相同的肝素（5 μM）混合，证实了HIPR在复杂基质中的稳健性。对n = 3个样本进行统计分析，比较不同终点荧光强度，采用双尾t检验（p  = 0.0004），结果表明差异具有统计学意义。

值得关注的是，该研究通过构建基于DNA聚合酶抑制效应的信号输出机制，使LAMP技术不再局限于核酸序列检测，而能够用于非核酸小分子的定量分析。这一思路为等温扩增技术在分子诊断领域的进一步拓展提供了新的研究方向。

作者信息与基金资助

论文第一作者为上海交通大学医学院-国家热带病研究中心全球健康学院2024届硕士毕业生解艺。通讯作者为全球健康学院殷堃研究员和东南大学公共卫生学院丁雄研究员。本研究还得到北卡罗来纳州立大学魏青山教授的帮助与指导。研究工作获得多项国家自然科学基金和上海市自然科学基金项目资助。

论文信息

论文题目：Heparin's inhibition capability on DNA polymerase enables probe-free heparin quantification
发表期刊： Chemical Engineering Journal

DOI: 10.1016/j.cej.2026.174836