近期，新华医院临床遗传中心余永国团队对23例携带PURA基因变异的神经发育障碍（PURA-NDD）患者进行了基因型-表型分析，同时应用全基因组甲基化芯片对其中17例患者外周血DNA进行了检测和分析。发现了一些之前未被报道的新表型，同时全基因组DNA甲基化分析揭示了PURA-NDD独特的甲基化谱，携带 PURA 单倍剂量不足变异和错义变异的患者具有相似的 DNA 甲基化特征，通过机器学习建立的分类模型帮助3例携带PURA意义不明错义变异重新分类为致病变异，进一步体外实验结果显示PURA错义变异与截短变异的细胞均显示Pur-α表达下调，表明存在共同的单倍剂量不足机制。该研究首次建立了PURA-NDD的甲基化谱，其可以帮助识别和诊断不典型PURA-NDD 患者，体现了其在遗传疾病诊断中的价值，同时为进一步的机制研究提供给了基础。

　　文章发表于Genet in Medicine杂志，第一作者为新华医院临床遗传中心肖冰和代伟倩，通许作者为徐娜和余永国。

　　研究对象和方法

　　对23例携带PURA基因杂合P/LP, VUS 或者PURA 基因缺失的病例进行基因型-表型分析。对其中17例患者外周血DNA 样本应用全基因组甲基化芯片（Illumina Infinium methylation EPIC V1.0 BeadChips）进行检测和分析。携带PURA P/LP变异或5q31.3缺失的8个病例样本以及与年龄、性别和芯片类型匹配的对照样本作为发现队列。

　　研究成果

　　全基因组差异甲基化位点分析发现两组间存在1802 差异甲基化位点（DMPs）（Δβ＞10%， adjusted P＜0.05）。进一步的筛选将DMPs缩小到480个位点。使用筛选的探针对样本进行聚类分析和PCA，结果均可以将病例组和正常对照进行有效区分（图1）。以上结果提示PURA 单倍剂量不足致病变异可以导致特征性甲基化谱。接下来应用建立的甲基化谱去预测其他携带PURA-LoF 变异的患者和正常对照，结果显示新的患者和训练集的病例聚集，而对照和训练集的正常对照聚类，提示了该甲基化谱的敏感性。随后，应用该甲基化谱对3例携带意义不明错义变异的患者进行预测，发现3例患者均和训练集携带单倍剂量不足变异的患者聚类（图2）。这一结果提示了3个错义变异可能通过单倍剂量不足机制导致疾病发生。

　　为了进一步验证该甲基化谱的敏感性和特异性，我们应用筛选的探针去建立和训练SVM分类器。结果显示，所有携带PURA变异个体MVP 值均很高，三个意义不明确的PURA错义变异被分类为致病性。相比之下，其他从GEO样本下载的其他样本的分数都小于0.5，被分类为“非PURA”（图2）。然而，由于在GEO数据库中下载的综合征存在批次效应，因此需要使用来自相同微阵列平台的更多数据来验证PURA-NDD甲基化谱的特异性。

　　进一步，我们推测错义变异和LoF变异具有相似的甲基化改变，部分原因可能是因为两种类型的变异都是通过减少蛋白表达来导致疾病发生。我们接下来通过病人外周血淋巴细胞永生化细胞株以及体外构建的突变体进行Western blot 检测，发现所有LoF变异和错义变异的细胞均显示Pur-a表达量降低。因此提示这两种PURA突变类型可能通过共同的单倍剂量不足机制导致疾病发生，并与两者具有相似的甲基化谱改变相关。

　　结论

　　PURA-NDD的患者表现出特征性的甲基化谱，该甲基化谱将有助于识别和诊断PURA-NDD患者，并为进一步的功能研究提供了启示。